本文整理了 4 种常见的蛋白互作实验方法，详细介绍 酵母双杂交（Y2H）、GST Pull-Down、亲和纯化质谱（AP-MS） 和 免疫共沉淀（Co-IP） 的实验原理，希望对你有所帮助🌟

1. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）

（图像来自www.lifeasible.com）

原理

酵母双杂交技术基于真核转录因子的模块化功能，将 DNA 结合域（BD）和转录激活域（AD）分离。其核心思想是将两个候选蛋白（如 A 和 B）分别与 BD 和 AD 融合，分别称为诱饵蛋白和靶蛋白。如果 A 和 B 之间存在物理相互作用，则两部分重新结合形成功能性转录因子，激活下游报告基因（如 HIS3 和 lacZ）的表达。

具体步骤：

  1. 构建融合蛋白：通过基因工程将候选蛋白分别与 BD 和 AD 融合，构建表达载体。
  2. 酵母转化：将两个载体共同转入酵母细胞，表达融合蛋白。
  3. 筛选与检测：通过报告基因表达（如利用缺陷型培养基检测 HIS3 表达或显色反应检测 lacZ 表达），判断蛋白间是否存在相互作用。

补充说明

报告基因系统：常用的报告基因包括 HIS3（使酵母在缺陷培养基中生长）、lacZ（产生β-半乳糖苷酶，引发显色反应）。
优化条件：融合蛋白表达和互作发生在酵母细胞核内，需要避免可能的错误定位。

2. GST Pull-Down

（图像来自medicine.biorun.com）

原理

GST pull-down 技术是一种体外蛋白质相互作用检测方法，通过将目标蛋白融合至谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标签，利用 GST 与谷胱甘肽（GSH）之间的高亲和力将目标蛋白固定在亲和基质上，再通过结合实验检测是否存在候选互作蛋白。

具体步骤：

  1. 融合蛋白表达和纯化：构建 GST-目标蛋白融合蛋白表达载体，在大肠杆菌中表达并纯化。
  2. 固定融合蛋白：将 GST 融合蛋白与预装有谷胱甘肽的琼脂糖珠（GSH-beads）结合。
  3. 候选蛋白孵育：将候选互作蛋白（通常为细胞裂解液中的蛋白）加入珠子体系，允许结合。
  4. 洗脱与分析：通过缓冲液洗去未结合蛋白，用 SDS-PAGE 电泳和免疫印迹检测结合的候选蛋白。

补充说明

结合条件优化：通过调整缓冲液成分（如盐浓度、pH 值）减少非特异性结合。
实验局限性：实验环境为体外条件，不完全模拟体内的复杂环境，可能导致结果与生理条件不一致。

3. 亲和纯化质谱（Affinity Purification Mass Spectrometry, AP-MS）

（图像来自文献《2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes》，doi:10.3791/57720）

原理

亲和纯化质谱结合了蛋白捕获技术和高通量质谱分析，用于检测目标蛋白与其结合伙伴之间的相互作用。通过抗体或标签结合捕获目标蛋白及其复合物后，用质谱仪识别互作蛋白。

具体步骤：

  1. 标签标记或内源性捕获：通过基因工程将目标蛋白标记特定标签（如 FLAG、HA），或者直接利用抗体识别内源性目标蛋白。
  2. 细胞裂解与结合：将细胞裂解液与抗体或亲和基质结合，捕获目标蛋白及其互作复合物。
  3. 洗脱与纯化：用洗脱缓冲液分离捕获物，同时去除非特异性结合蛋白。
  4. 质谱分析：通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）对互作蛋白进行鉴定和定量。

补充说明

4. 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）

原理

免疫共沉淀是一种体内蛋白质互作检测方法，利用抗体特异性结合目标蛋白，通过结合复合物一同沉淀并分析互作蛋白。它被广泛用于验证天然条件下的蛋白质互作。

具体步骤：

  1. 细胞裂解：利用温和裂解缓冲液保持蛋白复合物的天然状态。
  2. 抗体结合：将目标蛋白特异性抗体加入裂解液中，与目标蛋白结合形成免疫复合物。
  3. 沉淀与洗涤：通过 Protein A/G beads 捕获抗体-蛋白复合物，洗涤去除非特异性结合。
  4. 检测互作蛋白：通过 SDS-PAGE 和免疫印迹（Western Blot）分析互作蛋白。

补充说明

抗体选择：高特异性和高亲和力抗体是成功的关键。
实验优化：避免裂解过程中过多破坏复合物，减少背景噪声。

总结

方法 优点 缺点 适用方向
酵母双杂交 高通量筛选，适合检测大规模互作网络；可用于功能位点研究。 可能存在假阳性和假阴性；依赖蛋白在酵母中的正确折叠与功能保持。 高通量初筛、发现未知蛋白互作。
GST Pull-Down 验证直接蛋白互作的经典方法；实验操作简单，结果直观。 仅限体外条件，不能反映体内天然状态；对蛋白纯度要求高。 验证两个蛋白之间的直接互作。
亲和纯化质谱 高分辨率，可检测复杂网络；能同时识别多种互作蛋白。 样品制备复杂，对实验条件要求高；数据分析难度较大。 高分辨率的蛋白互作组学研究。
免疫共沉淀（Co-IP） 可反映体内天然状态的蛋白互作，可信度高；保留细胞/组织中的天然环境。 需高质量抗体，灵敏度低；可能因非特异性结合产生噪声。 检测体内蛋白天然互作。